本文是学习GB-T 19495.9-2017 转基因产品检测 植物产品液相芯片检测方法. 而整理的学习笔记,分享出来希望更多人受益,如果存在侵权请及时联系我们
GB 19495 的本部分规定了转基因成分的液相芯片定性检测方法。
本部分适用于玉米、大豆、油菜、水稻、棉花等转基因植物及其产品 CaMV35S
和 NOS 基因的定性
检测。
下列文件对于本文件的应用是必不可少的，凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文
件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。
GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法
GB/T 19495.1 转基因产品检测 通用要求和定义
GB/T 19495.3 转基因产品检测 核酸提取纯化方法
GB/T 19495.7 转基因产品检测 抽样和制样方法
下列缩略语适用于本文件。
PCR: 聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction)
MFI: 中位荧光强度值(Median Fluorescence Intensity)
SA-PE: 链霉亲和素-藻红蛋白(Streptavidin R-Phycoerythrin)
液相芯片技术以荧光编码微球为基础，微球表面带有大量的活性基团，可与核酸探针、抗原、抗体等
分子偶联。微球在制备过程中掺入了红色和橙色两种染料按照比例混合而成的荧光染料，两种染料分
通过不同配比赋予了微球不同的颜色，从而把微球分为很多种，每种微球特异性的偶联针对目的
DNA
序列的寡核苷酸探针，就可以标记100种不同的探针分子。然后依次加入目的分子和带有荧光的报告
分子，不同微球上的探针分子与不同的目的分子实现特异性结合，形成一个灵活性的液相芯片系统。该
方法的信号识别与检测技术是流式细胞术，它可以将微球体快速排成单列通过检测通道，使用红色和绿
色两束激光对单个微球进行照射，红色激光通过分辨微球本身的光谱学指纹将微球分类对反应进行定
性；绿色激光通过检测微球上结合的荧光报告分子量对反应进行定量。所得到的荧光信号经过光电倍
增管后经电脑处理，最后对数据进行分析，得出结果。检测时，液相芯片检测仪只记录两种荧光同时出
现时的荧光信号，不记录未结合的荧光报告分子信号。
本标准针对通用筛选元件CaMV35S 启动子和 NOS
终止子设计选取特异性引物和探针进行液相
芯片检测，并根据检测结果来判定CaMV 35S启动子和NOS
终止子的外源筛选元件成分。
GB/T 19495.9—2017
除非有特殊说明，仅使用分析纯试剂和符合GB/T 6682规定的一级水。
推荐针对不同的样品基质类型选取不同的基因组提取试剂盒。
5.2 18srRNA 基因引物和探针
18s-F:5'-CCTGAGAAACGGCTACCAT-3'
18s-R:5'-生物素-CGTGTCAGGATTGGGTAAT-3'
18s-P:5'-氨基-12个碳基-TGCGCGCCTGCTGCCTTCCT-3'
5.3 CaMV35S 启动子基因引物和探针
CaMV35S-F:5'-ATTGATGTGATATCTCCACTGACGT-3'
CaMV35S-R:5'- 生物素-CCTCTCCAAATGAAATGAACTTCCT-3'
CaMV35S-P:5'- 氨基-12个碳基-CCCACTATCCTTCGCAAGACCCTTCCT-3'
NOS-F:5'-CATGTAATGCATGACGTTATTTATG-3'
NOS-R:5'-生物素-TTGTTTTCTATCGCGTATTAAATGT-3'
NOS-P:5'- 氨基-12个碳基-ATGGGTTTTTATGATTAGAGTCCCGCAA-3’
羧基荧光微球，有5.6 μm 或者6.5 μm
两种规格，不同编号微球可偶联不同探针。
用于PCR 扩增反应，含有 Tris-HCl(pH 8.3)、KCl和 MgCl₂。
含有 dATP、dTTP、dCTP 和 dGTP (各2.5 mmol/L)。
具有3' → 5'核酸外切酶活性的耐热性 DNA 聚合酶(5 IU/μL)。
氯化四甲胺(tetramethylammonium chloride)杂交液。
6.3 PCR 仪，平均温度变化速度0.1℃/s。
GB/T 19495.9—2017
6.4 液相芯片检测仪，报告激光：532 nm; 分类激光：635 nm。
按照GB/T 19495.1和 GB/T 19495.7 的规定执行。
按照GB/T 19495.1和 GB/T 19495.7 的规定执行。
按照GB/T 19495.1和 GB/T 19495.3 的规定执行。
按照GB/T 19495.1和 GB/T 19495.3 的规定执行。
7.5.1.1 PCR 反应体系
PCR 反应体系应在Ⅱ级生物安全柜中操作。50μL 反应体系中含10×PCR Buffer 5
μL,
2.5 mmol/L dNTP 4 μL,10 μmol/L
的上下游引物(包括18s-F、18s-R、CaMV35S-F、CaMV35S-R、
NOS-F 和 NOS-R) 各 1 μL,DNA 模板1μL(100 ng),Ex Taq
酶0.5μL,补双蒸水至终体积50μL。每 个DNA
样品做2个平行管(若平行误差超过10%,应重新检测)。加样时应使样品DNA
溶液完全加入
反应液中，不要粘附于管壁上，加样后应尽快盖紧管盖，用涡旋震荡仪混匀。
7.5.1.2 PCR 反应条件
95℃预变性5 min;94℃ 变性30 s,58℃ 退火30 s,72℃ 延伸30 s,35
个循环；72℃延伸10 min。
7.5.1.3 对照设置
在液相芯片检测样品的同时，应设置阴性对照与空白对照，以与试样相同种类的非转基因植物基因
组 DNA 作为阴性对照；以水作为空白对照。
各对照的 PCR 反应体系中，除模板外，其余组分及 PCR
反应条件与7.5.1.1相同。
设定样品名称、探针编号和类型，微球数量等。
7.5.3 杂交反应体系与杂交反应条件
7.5.3.1 杂交反应体系
50μL 杂交反应体系中包括：1.5×TMAC 杂交液33μL, 与18s-P、CaMV35S-P、NOS-P
三种探针 (探针浓度为100 μmol/L) 偶联的微球各0.5 μL
(每种微球约5000个),Tris盐酸盐(pH=8) 缓冲液
15μL,PCR 产物2μL,空白孔以2μLTris 盐酸盐(pH=8) 缓冲液取代PCR
产物，阴性对照孔加2 μL
GB/T 19495.9—2017
阴性 PCR 产物。
7.5.3.2 杂交反应条件
95℃变性5 min,58℃ 杂交30 min, 加 入 1 ×TMAC 杂交液稀释的 SA-PE(2
μg/mL)100 μL,
58℃孵育10 min。
按预先设定的样品摆放顺序将杂交后的反应液转移到检测板上，运行仪器进行荧光检测。
在设置的读数时间内，荧光编码微球个数≥20个，表明用于计数的荧光编码微球数量有效，所产生
的中位荧光强度(MFI) 值可信；各个荧光编码微球的空白对照 MFI
均不高于300,表明结果有效，试验
可进行结果判定；若内标准基因未出现阳性结果，说明实验不成功，需重新进行检测。
测试样品的中位荧光强度(MFI)
大于或等于空白对照值的3倍即可判为阳性结果。
测试样品的中位荧光强度(MFI)
大于空白对照值的2倍小于空白对照值3倍判为可疑，需进行重
复检测或采用其他方法确认。
测试样品的中位荧光强度(MFI) 小于空白对照值的2倍即可判为阴性结果。
8.3.1 内标准基因出现阳性结果，并且外源 CaMV35S 或 NOS
基因的任何一个检出阳性，这表明试样 中检测出了CaMV35S 或 NOS
基因，表述为"试样中检测出了CaMV35S 或 NOS 基因成分，检测结果
为内源18SrRNA 基因出现阳性结果，CaMV35S 或 NOS
基因出现阳性结果，检测灵敏度为0.01%"。
8.3.2 内标准基因出现阳性结果，而 CaMV35S 或 NOS
基因未检出阳性，这表明试样中未检测出 CaMV35S 或 NOS
基因成分，表述为"试样中内源18SrRNA 基因出现阳性结果，检测灵敏度为0.01%,
未检测出 CaMV35S 或 NOS 基因成分"。
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